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Este artículo es altamente técnico y de difícil lectura; lo ofrecemos porque da una buena explicación de cómo el VIH subtipo B se trasladó de África a Haití por 1966 (1962 a1970), donde se difundió antes de emigrar por 1969 (1966 a 1972) hacia el mundo. En Estados Unidos circuló inadvertido cerca de 12 años antes de ser reconocido en 1981.

PNAS � Noviembre 20, 2007 vol. 104 no. 47. EVOLUCIÓN

La aparición del VIH/SIDA en las Américas y más allá

M. Thomas P. Gilbert*, Andrew Rambaut, Gabriela Wlasiuk*, Thomas J. Spira§, Arthur E. Pitchenik, and Michael Worobey*

*Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Arizona, Tucson, AZ 85721; †Ancient DNA and Evolution Group, Centre for Ancient Genetics, Niels Bohr Institute and Biological Institute, University of Copenhagen, DK-2100 Copenhagen, Denmark; ‡Institute for Evolutionary Biology, University of Edinburgh, Edinburgh EH9 3JT, United Kingdom,; §Division of HIV/AIDS Prevention, National Center for HIV/AIDS, Viral Hepatitis, STD, and TB Prevention, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333; and ¶Department of Medicine, University of Miami, Miami, FL 33125

Edited by John M. Cofn, Tufts University School of Medicine, Boston, MA, and approved September 17, 2007 (received for review June 6, 2007)

Author contributions: M.T.P.G., A.R., and M.W. designed research; M.T.P.G., A.R., and M.W. performed research; T.J.S. and A.E.P. contributed new reagents/analytic tools; A.R., G.W., T.J.S., A.E.P., and M.W. analyzed data; and A.R. and M.W. wrote the paper. The authors declare no conict of interest.

Abbreviations: TMRCA, time of the most recent common ancestor; MCMC, Markov chain Monte Carlo.

To whom correspondence should be addressed. E-mail: Esta dirección electrónica esta protegida contra spam bots. Necesita activar JavaScript para visualizarla .

This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/ 0705329104/DC1.

El HIV-1 grupo M subtipo B fue el primer Vih descubierto y es la variante predominante del virus del SIDA en la mayoría de los países fuera del África subsahariana. Sin embargo, las circunstancias de su origen y aparición siguen sin estar resueltas. Aquí proponemos una secuencia geográfica y una línea temporal para el origen del subtipo B y la aparición de la pandemia VIH/SIDA fuera de África. Usando secuencias de genes de VIH-1 recobradas de muestras de archivo de algunos de los más antiguos pacientes de SIDA haitianos conocidos, encontramos que el subtipo B probablemente se trasladó de África a Haití en 1966 o cerca de esa fecha (1962–1970) y después se dispersó allí durante algunos años antes de dispersarse a los demás sitios. Una clades ‘‘pandémica’’, que abarcaba la vasta mayoría de las infecciones subtipo B no haitianas de los Estados Unidos y otros puntos del mundo apareció subsiguientemente en una única migración del virus fuera de Haití en 1969 o cerca de esa fecha (1966–1972). Haití parece tener la epidemia de VIH/SIDA más antigua fuera del África subsahariana y la epidemia de subtipo B genéticamente más diversa, lo que podría presentar dificultades para el diseño y testeo de una vacuna de VIH-1. La aparición de la variante pandémica del subtipo B fue una encrucijada importante en la historia del SIDA, pero su difusión probablemente fue impulsada por factores ecológicos y no evolucionarios. Nuestros resultados sugieren que el VIH-1 circuló crípticamente en los Estados Unidos alrededor de 12 años antes del reconocimiento del SIDA en 1981.

evolution � pandemic � phylogeny � archival � Haiti

Los árboles genéticos virales pueden ofrecer poderosas comprensiones sobre los procesos ecológicos y evolucionarios (1). Los patrones filogenéticos de nivel de población reflejan tanto la dinámica de la transmisión como el cambio genético, que a su vez puede acumularse a causa de la selección (impulsada, por ejemplo, por la inmunidad del huésped) o ir a la deriva. En este estudio usamos un abordaje genético y secuencias genéticas de VIH-1 recobradas de víctimas tempranas del SIDA para investigar cuándo, dónde y cómo surgió y salió el VIH-1 de África para difundirse en todo el mundo. Aunque explica menos infecciones que el subtipo C, que domina la epidemia de VIH en África Meridional y la India y se está esparciendo en otras partes, se puede sostener que el VIH-1 grupo M subtipo B es la variante de VIH más difundida de todas. Ningún otro subtipo o forma recombinante en circulación predomina en tantos países de todo el mundo (3). Nuestro objeto aquí es combinar las perspectivas filogenética, evolucionaria molecular, histórica y epidemiológica en un intento de reconstruir la historia de la pandemia de subtipo B. Este conocimiento retrospectivo puede clarificar el pasado pero también puede potencialmente ser de valor para un diseño racional de la vacuna, que tome en cuenta la diversidad genética del virus (4), y puede servir para predecir la futura complejidad de la diversidad genética regional y global del VIH-1. Ésta es una función de la frecuencia con que las cepas de VIH-1 se dispersan a gamas geográficas y poblaciones huésped, y luego las colonizan exitosamente, cuestión que enfocamos aquí.

La idea de que Haití pudiera haber jugado un papel especial en el desenvolvimiento de la pandemia de SIDA está presente en el descubrimiento del VIH. Poco después del reconocimiento inicial del SIDA (5), la evidencia de una alta prevalencia del síndrome entre los inmigrantes haitianos de los Estados Unidos (6) ayudó a alimentar la especulación de que Haití podría haber sido la fuente del misterioso nuevo síndrome, recién identificado (7). Desde aquel entonces ha llegado a estar claro que el agente causativo, el VIH-1 grupo M, en realidad no se originó en Haití sino en África central, aparentemente en algún momento alrededor de 1930 (8, 9).

Sin embargo, sigue existiendo la posibilidad de que Haití haya sido el punto de partido de la aparición del linaje del subtipo B, excepcionalmente difundido, y esta idea tiene implicaciones que se extienden más allá del interés histórico. Algunos investigadores han notado que las secuencias haitianas del VIH-1 tienden a ocupar posiciones basales en la filogenia del subtipo B, lo que sugiere que la epidemia se originó allí (9–11). Otros arguyen vigorosamente que la epidemia de VIH/SIDA haitiana fue inseminada desde los Estados Unidos, quizás después de que Haití se volvió un destino popular de turismo sexual a mediados de los setenta (12–14). Sin embargo, estas hipótesis en competencia no han sido nunca testeadas rigurosamente, a pesar de su importancia para entender la difusión mundial y la diversidad genética del VIH-1, relevante para la vacuna. Para testear estas hipótesis, recobramos secuencias genéticas completas env de VIH-1 y secuencias gag parciales de especimenes dde archivo reunidos en 1982-3 de pacientes haitianos, todos los cuales recientemente habían inmigrado de los Estados Unidos y estaban entre las primeras víctimas reconocidas de los Estados Unidos (6). Estas secuencias de archivo, al ser independientes y mucho más viejas que las cepas VIH-1 haitianas publicadas previamente, ofrecen una oportunidad única en su género para resolver el origen y aparición del subtipo B. Proveen comprensión directa de la diversidad genética del VIH-1 haitiano en un momento del tiempo excepcionalmente temprano, y una muestra no sesgada para el testeo de las hipótesis filogenéticos especificadas a priori que enfocamos aquí.

 

Resultados y Discusión El Origen Geográfico del Subtipo B. En el modelo ‘‘Haití-primero’’, de las cepas de subtipo B no haitianas se espera que filogenéticamente esté anidadas dentro de una gamas más vieja y por tanto más extensa de la variación genética haitiana, con los linajes haitianos formando ramas cercanas del ancestro del subtipo B. Para testear si es este patrón o uno alternativo el que caracteriza a este sutbiptivo de VIH-1 [informacion de apoyo (SI) Fig. 3], condujimos un anàlisis filogenético de cadena Monte Carlo Bayesiana Markov detallada (MCMC) usando una alineación de las secuencias de archivo haitianas más 117 secuencias env subtipo B previamente publicadas de un total de 19 países. Cinco cepas africanas del subtipo D (el pariente más próximo del subtipo B) servieron como grupo exterior.

En la filogenia del gene env, las secuencias de archivo ocupan posiciones basales dentro del subtipo B (Fig. 1 y SI Fig. 4); hay un apoyo estadístico extremadamente fuerte en favor de un origen haitiano del subtipo B, en el hecho de que la probabilidad de un origen estadounidense u otro origen no haitiano [i.e., la probabilidad posterior de que cualquier secuencia (o secuencias) no haitiana(s) ocupara(n) la posición más basal de la clade B es 0.001. Estos resultados indican, con alta significación estadística, que el subtipo B llegó y comenzó a esparcirse en Haití antes de espacirse a otras partes y que no fue originariamente introducido en Haití a partir de los Estados Unidos. Además, el apoyo inequívoco a favor de la monofilia del subtipo B en su totalidad (P � 1.0) da apoyo a la sugerencia previa de una introducción única (epidémicamente exitosa) de este subtipo desde África Central a Haití (10).

Drummond et al. (15) descubrieron que los modelos de “reloj relajado” [relaxed-clock models] son más precisos y exactos al estimar relaciones filogenéticos que métodos desarraigados. En otras palabras, cuando los datos han evolucionado de un modo algo similar al de un reloj, incorporar el conocimiento del tempo de evolución puede hacer más confiable la estimación de la topología comparando con métodos que pasan por alto esta información. Por lo tanto, también estábamos interesados en lo que los resultados de reloj relajado (descritos más abajo) revelaron relativos a dónde se originó el subtipo B(i.e., las relaciones topológicas entre el las secuencias del subtipo B, sin tener en cuenta las longitudes de momento/rama). Con el modelo de reloj relajado, la probabilidad posterior de un origen estadounidense fue de 0.00003, y la probabilidad del origen haitiano 0.9979.

La inferencia de que el subtipo B había llegado a Haití antes de esparcirse a otros países no depende de un análisis de fechado. Una de las ventajas de un marco estadístico bayesiano es que cede estimaciones directas de la probabilidad de hipótesis filogenéticos, y en este caso hay una fuerte evidencia en pro de rechazar un origen del subtipo B estadounidense o de otro origen no haitiano. Esto significa que incluso si hubiera alguna incertidumbre en cuanto a cuándo precisamente el VIH-1 entró en Haití o los Estados Unidos (véase abajo), hay pocas dudas sobre la secuencia de eventos; la información topológica bien clara implica que la entrada a Haití ocurrió primero. Más todavía: nuestro sesgo de muestreo a favor del subtipo B no haitiano transforma en conservadora a la inferencia “Haití-primero’’; las cepas haitianas ocupan las posiciones basales dentro del subtipo B incluso con muchas más oportunidades de recobrar cepas basales no haitianas, si hubieran existido.

Figura 1

La dispersión del VIH-1 Fuera de Haití. Después investigamos cuántas veces la vieja epidemia de VIH-1 haitiano había inseminado brotes epidémicos secundarios detectables en otras partes. Encontramos evidencia de solamente tres eventos de este tipo, a persar de que nuestgros datos comprendían 109 cepas no haitianas de subtipo B del Caribe, Norte y Sudamérica, Europa, África, Asia, y Australia. Una instancia está limitada a Trinidad y Tobago (Fig. 1). Todas las secuencias de VIH-1 de este país forman un agrupamiento monofilético claro y distinto con el apoyo más fuerte posible(probabilidad posterior de of 1.0). Estudios previos han afirmado que el contacto homo/bisexual con extranjeros norteamericanos en los últimos años de los setenta o en los primeros de los ochenta son la ruta presunta de la introducción (16, 17). Nuestros resultados indican que éste no fue el caso; la clade de Trinidad y Tobago está inequívocamente anidada en cepas haitianas, no norteamericanas, lo que es evidencia clara de que la epidemia predominantemente heterosexual de este país puede ser explicada por una introducción única vinculada con Haití.

La siguiente más importante epidemia secundaria explica todos excepto tres de las cepas remanentes no haitianas, abarcando 96 secuencias que representan todos los demás países de nuestro conjunto de datos (Fig. 1). Esta clade ‘‘pandémica’’ forma otro conjunto inequívocamente monofilético (P � 1.0) anidado con las cepas basales haitianas. En cuanto a la clade Trinidad y Tobago clade, la explicación más parsimoniosa de este patrón es que todas estas infecciones de subtipo B de todo el mundo emanaron de un único suceso fundacional vinculado con Haití. Esto muy probablemente ocurrió cuando el virus de la clade pandémica ancestral cruzó desde la comunidad haitiana de los Estados Unidos a la población no haitiana.

El único otro brote epidémico vinculado a Haití que detectamos es comparativamente insignificante, y comprende aquí una secuencia brasileña (BR020) y otra nhorteamerciana (US4). Cadenas raras de transmisión adicionales pueden haber surgido de Haití pero permanecieron indetectables para este estudio. De igual modo, los virus de la clade pandémica pueden haber reentrado en Haití, pero fueron indetectables. Sin importar esto, es evidente de esta gran muestra internacional que la epidemia de subtipo B en los países más afligidos y la mayor parte de las infecciones del subtipo B son causadas por virus que pertenecen solamente a la clade pandémica.

fig2

 

 

1950 1960 1970 1980 1990 2000

Fig. 2. The consensus tree of the relaxed molecular clock analysis, with the Haitian archival sequences bulleted. The tips of the tree correspond to year of sampling, and the branch lengths reect the mean of the posterior probability density. The posterior probability density for the TMRCA for subtype B in Haiti is depicted in dark green, and the 95% highest probability density (HPD) is shown by the horizontal bar and light-green shading. The TMRCA means and 95% HPDs for the other key nodes were as follows: subtype B/D ancestor 1954 (1946–1961); subtype D ancestor 1966 (1961–1971); Trinidad and Tobago subtype B ancestor 1973 (1970–1976); and U.S./Canada subtype B ancestor 1969 (1966–1972). This analysis resolves the position of the archival sequence H6 as basal to the pandemic clade. Under the relaxed molecular clock, Pnon-Haitian-origin 0.00003, Psimultaneous-origin 0.0021, and PHaitian-origin 0.9979.

 

Tres cepas adicionales nominalmente no haitianas son dignas de mención porque caen entre los linajes basales haitianos y no entre las tres clades no haitianas (Fig. 1). Cada una provee un apoyo más para la idea de que las cepas vinculadas con Haití ocupan las ramas más profundas dentro del subtipo B. RF fue muestreada in 1983 de un inmigrante haitiano a los Estados Unidos. Como nuestras cinco cepas nuevamente secuenciadas, representada una cepa haitiana que entró en los Estados Unidos por vía de un huésped inmigrante (10). WMJ2 fue muestreada en 1985 de un infante infectado perinatalmente de una madre haitiana inmigrante VIH positiva(18). KR5086 fue recobrada en 1995 de un marinero surcoreano infectado en la República Dominicana (19), un país directamente vinculado a Haití en términos tanto de geografía como de epidemiología del VIH-1 (20). Estos casos, más los casos adicionales considerados en nuestro estudio, muestro que el virus salió de Haití en varias ocasiones separadas pero que fundamentalmente lo hizo en forma de infecciones terminales [= no transmitidas, dead-end infections] que evidentemente no pudieron encender nuevas epidemias. Una pregunta clave para la investigación futura será determinar por qué los brotes epidçemicos de Haití-a-EEUU aparentemente se establecieron tan raramente a partir de la introducción inicial en o cerca de 1969, a pesar presumiblemente del frecuente movimiento del virus a causa de la prevalencia VIH-1 creciente, la migración continua y el entonces rampante turismo sexual que vinculaba Haití y los Estados Unidos.

Varios análisis adicionales corroboraron estos resultados. Primero, reanalizamos nuestro datos de genes env gene reemplazando las secuencias del grupo externo, el subtipo africano D, con una variedad de alternativas de diferentes subtipos y regiones geográficas. Esto no tuvo impacto en la posición basal de las cepas haitianas dentro del subtipo B (Fig. 5a); su posición ancestral no puede ser dejada de lado considerándola un artefacto de la evolución convergente con las secuencias del subtipo D. Segundo, las secuencias gag también sin ambigüedades ubican las secuencias haitianas en las posiciones más ancestrales dentro del subtipo B (P � 0.9930) (SI Fig. 5b). También inspeccionamos las sustituciones de nucleótidos que mapeaban específicamente hacia la rama que conducía hacia la clade pandémica. Para env, la totalidad de estos ocho cambios estuvieron silenciosos en el nivel del aminoácido. Para gag, solamente uno de los seis cambios de la rama relevante indicaban un cambio en el aminoácido entre las cepas haitianas y las cepas de la clade pandémica. La escasez de las sustituciones de aminoácidos a lo largo de esta rama definitoria de la clade sugiere que el ancestro de la clade pandémica probablemente no poseía ventaja selectiva por encima de otras cepas haitianas; su notable éxito epidémico puede simplemente reflejar factores ecológicos y no evolucionarios (colonización casual de una población nueva, en cuanto opuesta a aptitud de transmisión competitivamente superior). Sin embargo, sería necesario el anàlisis de genomas completos para descartar definitivamente la selección.

 

El Momento de la Aparición del Subtipo B. Usamos un segundo método MCMC bayesiado que simultáneamente estimaba las relaciones filogenéticos y los tiempos de los ancestros comunes más recientes (15) para ejecutar un análisis filogenético suplementario sobre un conjunto de datos reducido. Este método usa un modelo de ‘‘reloj molecular relajado [relaxed molecular clock]’’, así llamado porque afloja la necesidad de asumir una tasa constante de evolución molecular a través del árbol para obtener estimaciones de fecha a partir de las secuencias de genes. Estimamos el Tiempo del Más Reciente Común Ancestro (TMRCA) del subtipo B en 1966 (1962–1970) (Fig. 2), fecha que sugiere que su llegada a Haití puede haberse producido con el retorno de uno de los muchos profesionales haitianos que trabajaron en el recién independizado Congo en los sesenta (21).

El TMRCA de la epidemia norteamericana se estima que es 1969 (1966–1972) (Fig. 2), lo que sugiere que el VIH-1 estaba circulando crípticamente en los Estados Unidos por �12 años antes del reconocimiento inicial del SIDA en 1981. La evidencia de un único origen de la variante pandémica del subtipo B nos permitió fecha el comienzo de la actual epidemia norteamericana de HIV-1, en lugar del ancestro de virus múltiples introducido desde Haití; si se hubiesen producido introducciones múltiples desde Haití, el Más Reciente Ancestro Común de EEUU [‘‘U.S. MRCA’’] en realidad hubiera correspondido a un virus haitiano que habría predado la entrada inicial del VIH-1 en los Estados Unidos (11). La evidencia serológica de una prevalencia de �5% de VIH-1 al llegar 1978 en poblaciones de hombres que hace sexo con hombres (HSH) tanto en San Francisco (22) como en la ciudad de Nueva York (23) sugiere que vario mies de individuos en los Estados Unidos ya habrían sido infectados para ese momento. Incluso asumiendo las tases de crecimiento más rápidas documentadas para el VIH-1 (24), esto implica que el virus había estado difundiéndose en la población HSH por varios años antes de este momento, lo que es consistente con nuestros resultados aquí. El virus bien puede haberse estado difundiendo lentamente por un período extenso, quizás en la población heterosexual, antes de entrar en la Subpoblación de más alto riesgo de HSH, donde se difundió de un modo suficientemente explosivo para que al fin fuese advertido. Sostenemos que la estimación filogenética, con intervalos de confianza apropiados, provee más información confiable sobre la fecha del origen de la epidemia norteamericana que los datos epidemiológicos disponislbes, que no pueden resolver esta cuestión.

Sin embargo, aunque nuestros métodos de reloj relajado deberían ser razonablemente robustos para medir la variación entre linajes y la incertidumbre en inferencia filogenético, siempre hay que garantizar algo de precaución cuando se hacen estas inferencias. Por ejemplo, el muestreo relativamente escaso tanto de secuencias haitianas como de Trinidad significa que es concebible que un muestro más intensivo en el fuguro podría recobrar linajes de ramas más profundas y empujar hacia atrás levemente en el tiempo estas estimaciones de TMRCA. Sería improbable que esto se aplicara a los TMRCA estadounidenses, por otra parte, a causa del muestreo ya denso de esta población VIH-1. Si pueden ser obtenidas, las secuencias de archivo adicionales deberían ayudar a clarificar la difusión temprana del subtipo B con precisión mayor.

La brecha de tres décadas entre el tiempo estimado del ancestro grupo M del HIV-1 (9) y la evidencia más temprana de VIH/SIDA en África (25, 26) parece nada excepcional en comparación con el período críptico de los EEUU, especialmente porque una buena cantidad de mortalidad causada por tuberculosis en África debe haber pasado sin ser reconocida como un hecho relacionado con el VIH. Entonces igual que ahora. Tomada en conjunto con nuestro análisis de fechado, incluyendo el subtipo de ancestro B/D fechado en 1954 (1946–1961) (Fig. 2), el extenso período críptico en los Estados Unidos, por lo tanto, provee convincente corroboración de un ancestro grupo M de principios del siglo XX (9).

Conclusión

Nuestros descubrimientos simplemente implican que Haití tiene la epidemia de VIH/SIDA más antigua que se conozca fuera del África subsahariana, lo que ayuda a explicar la alta prevalencia del SIDA y el VIH-1 entre los haitianos en los primeros años de los ochenta. A causa de su historia de 40 años, la epidemia VIH-1 de Haití exhibe una gama de diversidad genética viral mayor que el resto de las cepas del subtipo B combinadas de todo el mundo, de modo muy similar a lo que la epidemia de VIH-1 de la República Democrática del Congo es para el grupo M como totalidad (27). Esto hace surgir la posibilidad de que las cepas del subtipo B en Haití u otra parte pudieran exhibir propiedades antigénicas claras y distintas o más diversas, comparadas con los virus de la clade pandémica. Las vacunas derivadas del consenso o de otras secuencias centrales quizás deberían basar en un muestreo extenso del VIH-1 haitiano si se tiene la intención de que cubran tanto las cepas del subtipo B haitiano como la clade pandémica.

Aunque desde hace mucho ha estado claro que los cuellos de botella poblacionales y los efectos de fundador son una característica de la pandemia de VIH/SIDA que se va desplegando, la serie de cuellos de botella que puntuaron la aparición mundial del subtipo B es notable. La falta de evidencia sobre selección asociada con la difusión de la clade pandémica de subtipo B, por lo demás, apunta a la importancia de eventos causales e interacciones ecológicas en impulsar lo que fue quizás la dispersión de VIH-1 más explosiva del mundo.

Nuestras estimaciones filogenéticas de línea de tiempo dan asidero a previas observaciones epidemiológica que, por sí mismas, no pueden dar fecha convincentemente al origen de la epidemia regional. Tomadas en conjunto, estas fuentes de información sugieren que el VIH-1 estuvo circulando en uno de los contextos médicamente más sofisticados del mundo por más de una década antes de que se reconociera el SIDA.

Methods The Archival Samples. Peripheral blood mononuclear cell (PBMC) samples were collected in 1982 and 1983 at Jackson Memorial Hospital in Miami, FL, during one of the first investigations establishing that Haitians in Haiti and elsewhere were at risk for AIDS (6). One of the six PBMC samples obtained for this study failed to yield any amplifiable HIV-1 PCR products. As described in Pitchenik et al. (6), all of the patients were Haitian immigrants who had entered the United States after 1975 and progressed to AIDS by 1981 and hence were presumably infected with HIV-1 before entering the United States. The position of these sequences on the subtype B phylogeny (distinct from and basal to the dominant U.S. variant of subtype B) is consistent with this sequence of events.

 

Amplification and Sequencing of Archival HIV-1 DNA. DNA was extracted from 10 l of peripheral blood mononuclear cells by using QIAamp DNA micro kits (Qiagen, Valencia, CA), follow­ing the manufacturer’s instructions for extractions from blood. After extraction, DNA was eluted into 100 l of elution buffer AE and stored frozen at 20°C until required for DNA analyses. DNA was PCR-amplified from the extracts by using a nested PCR approach (28). First-round PCRs were undertaken in 25 l of final volume reactions, using 0.1 l of Platinum Taq HiFi enzyme (Invitrogen, Carlsbad, CA)/0.1 lof25mMdNTP mix/2.5 mM (final concentration) MgSO4/10 PCR buffer/1–5

l of DNA extract. Second-round amplifications were per­formed on 1 l of the first-round PCR product by using the same reagent concentrations. Enzyme activation, dissociation, and extension temperatures followed the manufacturer’s guidelines, with an extension time of 3 min. Annealing temperatures varied by extract in response to initial amplification success rates.

After amplification, the PCR products were visualized on 0.8% agarose gels stained with ethidium bromide and then purified by using QIAquick spin columns (Qiagen). Purified products were sequenced by using several overlapping primer pairs (28) by the University of Arizona Genomic Analysis and Technology Core Facility with ABI Big Dye 3.1 chemistry (Applied Biosystems, Foster City, CA) on Applied Biosystem 3730xl DNA Analyzers. Each sample was extracted, PCR-amplified, and sequenced twice to ensure that the sequences generated were not modified through low template copy num­ber. We recovered five full-length env sequences and five partial (0.7-to 1.2-kb) gag sequences.

 

Sequence Alignments. We used the Los Alamos National Labo­ratory HIV sequence database (29) to download all full-length published env and gag gene sequences of subtypes B and D. We then subjected the resulting sequence set to strict quality control measures to remove (i) incomplete sequences; (ii) sequences not published in a peer-reviewed journal; (iii) multiple sequences from the same patient; (iv) sequences suspected a priori of possibly anomalous evolutionary patterns (from long-term non­progressors with nef deletions, laboratory workers infected accidentally, sequences exhibiting evidence of hypermutation, etc.); (v) sequences with midpeptide stop codons, frame-shift mutations, or nonnucleotide characters; or (vi) sequences for which there was any uncertainty regarding which subtype they belonged to. To search for such sequences, which might include unidentified intersubtype recombinants, we screened all se­quences using the REGA HIV-1 Subtyping Tool (30) and then removed any sequence with bootstrapping support 100% or bootscanning support 1.0 for clustering with subtype B or D.

To ensure that no very-early-diverging subtype B strains were removed by this procedure, we inferred additional phylogenies that included the ‘‘cleaned’’ sequences (data not shown). For env, the only such strains that were positioned basal to the pandemic clade were from Trinidad and Tobago, and these clustered with the other sequences from the Trinidad and Tobago clade. Similarly, for gag, the only nonpandemic clade sequences that were removed (US4 and RF) were ones that had already been identified as basal in the env analysis; all other sequences with bootstrap or bootscan support 100% or 1.0 were from the pandemic clade. Unlike intersubtype recombinants, the possible nonexclusion of intrasubtype recombinants is not expected to affect inferences regarding the geographical origin and emer­gence of subtype B because intrasubtype recombination cannot plausibly lead to strains from one locality systematically falling basal to all of the others. Moreover, although unidentified intrasubtype recombination might increase the variance of dat­ing estimates, it is unlikely to systematically bias these dates in one direction or the other in an exponentially growing popula­tion (31).

The resulting data sets were codon-aligned and then adjusted by eye in Squint Ver. 1.0 (M. Goode, University of Auckland, Auckland, New Zealand), and regions of ambiguous alignment were removed. We constructed three additional env alignments replacing the D subtype outgroup with a subtype C sequence from India, a subtype A sequence from Kenya, or a CRF01 (A/E) sequence from Thailand. All previously published sequences (see the taxon labels in SI Figs. 4 and 5b) are available from the Los Alamos National Laboratory HIV sequence database. All alignments are available from the authors upon request.

 

The Bayesian MCMC Phylogenetic Analysis and Estimation of the Probability of a Haitian or non-Haitian Origin of Subtype B. We used MrBayes, Ver. 3.1 (32), to perform two independent runs of 20 million steps (for env). Examination of the MCMC samples with Tracer, Ver. 1.3 [A. Rambaut (University of Edinburgh) and A. J. Drummond (University of Auckland, Auckland, New Zealand); http://beast.bio.ed.ac.uk], indicated adequate mixing of the Markov chain. We discarded the first 2 million steps from each run as burn-in and combined the resulting MCMC samples (n 36,002) for subsequent estimation of posteriors. Fewer steps (5 million) were required for convergence and adequate mixing in the gag analyses. We used tree filtering in PAUP, Ver. 4.0b10 (33), to calculate the posterior probabilities of a Haitian, non-Haitian, or effectively simultaneous Haitian/non-Haitian origin of subtype B. Briefly, we removed from the posterior sample any tree with a Haitian se­quence(s) in the most basal position. Only 4 of 36,002 env trees had a non-Haitian basal sequence (Pnon-Haitian-origin 0.00011), and 24 others placed the Haitian and non-Haitian sequences in reciprocally monophyletic clades (Psimultaneous-origin 0.00066), which left 35,974 with a Haitian sequence or group of sequences, in the most-ancestral position(s) within subtype B (PHaitian-origin 0.9992). A similar approach was followed for the estimation of the probability of a Haitian or non-Haitian origin of subtype B for the gag and the relaxed-clock analyses.

For both the env and gag data sets, we used a parsimony approach as implemented in MacClade, Ver. 4.08 (34), to identify the nucleotide substitutions that mapped onto the branch leading to the pandemic clade of subtype B. We then determined whether these changes were synonymous or non-synonymous.

 

The Relaxed Molecular Clock Analysis. To infer the timescale of HIV-1 group M subtype B evolution, we used a Bayesian molecular clock method (15), as implemented in BEAST (http:// beast.bio.ed.ac.uk), under an uncorrelated log-normal relaxed molecular clock model with a Bayesian Skyline coalescent tree prior. For this analysis to run in a reasonable time, we considered only subtype B sequences from Haiti, Trinidad and Tobago, and the United States (plus one from Canada), and we removed some pandemic clade sequences from overrepresented years and localities. The maximum a posteriori tree from the MrBayes analysis (available upon request) revealed that the sequences were scattered across the entire pandemic clade, consistent with a U.S. entry of the founding virus. We ran 10 independent MCMC analyses, with each run consisting of 100 million steps, and then discarded the first 5 million steps from each run as burn-in and combined the resulting postburn-in MCMC samples for subsequent estimation of posteriors.

 

We thank David Robertson and Adam Bjork for comments. This work was supported by grants from the National Institutes of Health and the Packard Foundation (to M.W.). A.R. is supported by a Royal Society University Research Fellowship.

 

  1. Grenfell BT, Pybus OG, Gog JR, Wood JLN, Daly JM, Mumford JA, Holmes EC (2004) Science 303:327–332.

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Última actualización el Lunes, 27 de Julio de 2009 15:58